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    • 04-08-05

    解析 基因检测 三代检测设备

    当你面对各大基因公司鼓吹自己检测手段时,你是否觉得各执一词,都很有道理,今天客观地为大众分析一下"基因检测"三代检测设备的优劣势,让你再次面对他们的"专业"时,你不再显得无所适从。

    DNA测序技术是现代分子生物学研究中最常用的技术。从1977年第一代测序技术的出现,经过30多年的发展,DNA测序技术取得重大进展,以高通量为特点的第二代测序技术逐步成熟并商业化,以单分子测序为特点的第三代测序技术也已经出现。展望新的测序技术对于未来生物学研究及人们自身健康与人类疾病等方面研究的影响。

    第一代测序技术-Sanger链终止法

    一代测序技术是20世纪70年代中期由Fred Sanger及其同事首先发明。其基本原理是,聚丙烯酰胺凝胶电泳能够把长度只差一个核苷酸的单链DNA分子区分开来。一代测序实验的起始材料是均一的单链DNA分子。第一步是短寡聚核苷酸在每个分子的相同位置上退火,然后该寡聚核苷酸就充当引物来合成与模板互补的新的DNA链。用双脱氧核苷酸作为链终止试剂(双脱氧核苷酸在脱氧核糖上没有聚合酶延伸链所需要的3-OH基团,所以可被用作链终止试剂)通过聚合酶的引物延伸产生一系列大小不同的分子后再进行分离的方法。测序引物与单链DNA模板分子结合后,DNA聚合酶用dNTP延伸引物。延伸反应分四组进行,每一组分别用四种ddNTP(双脱氧核苷酸)中的一种来进行终止,再用PAGE分析四组样品。从得到的PAGE胶上可以读出我们需要的序列。

    第二代测序技术-大规模平行测序

    大规模平行测序平台(massively parallel DNA sequencing platform)的出现不仅令DNA测序费用降到了以前的百分之一,还让基因组测序这项以前专属于大型测序中心的"特权"能够被众多研究人员分享。新一代DNA测序技术有助于人们以更低廉的价格,更全面、更深入地分析基因组、转录组及蛋白质之间交互作用组的各项数据。市面上出现了很多新一代测序仪产品,例如美国Roche Applied Science公司的454基因组测序仪、美国Illumina公司和英国Solexa technology公司合作开发的Illumina测序仪、美国Applied Biosystems公司的SOLiD测序仪。Illumina/Solexa Genome Analyzer测序的基本原理是边合成边测序。在Sanger等测序方法的基础上,通过技术创新,用不同颜色的荧光标记四种不同的dNTP,当DNA聚合酶合成互补链时,每添加一种dNTP就会释放出不同的荧光,根据捕捉的荧光信号并经过特定的计算机软件处理,从而获得待测DNA的序列信息。 以Illumina测序仪说明二代测序的一般流程:

    (1)文库制备,将DNA用雾化或超声波随机片段化成几百碱基或更短的小片段。用聚合酶和外切核酸酶把DNA片段切成平末端,紧接着磷酸化并增加一个核苷酸黏性末端。然后将Illumina测序接头与片段连接。

    (2)簇的创建,将模板分子加入芯片用于产生克隆簇和测序循环。芯片有8个纵向泳道的硅基片。每个泳道内芯片表面有无数的被固定的单链接头。上述步骤得到的带接头的DNA 片段变性成单链后与测序通道上的接头引物结合形成桥状结构,以供后续的预扩增使用。通过不断循环获得上百万条成簇分布的双链待测片段。

    (3)测序,分三步:DNA聚合酶结合荧光可逆终止子,荧光标记簇成像,在下一个循环开始前将结合的核苷酸剪切并分解。

    (4)数据分析

    第三代测序技术-高通量、单分子测序

    被称为第三代的测序的He-licos单分子测序仪,PacificBioscience的SMRT技术和Oxford Nanopore Technologies 公司正在研究的纳米孔单分子测序技术正向着高通量 低成本 长读取长度的方向发展。

    不同于第二代测序依赖于DNA模板与固体表面相结合然后边合成边测序,第三代分子测序,不需要进行PCR扩增。

    (1)Helico BioScience 单分子测序技术。该测序是基于边合成边测序的思想,将待测序列随机打断成小分子片段并用末端转移酶在 3' 末端加上 poly(A),以及在poly(A)的末端进行荧光标记和阻断,把这些小片段与带有poly(T)的平板杂交成像来获得已经杂交模板所处的位置,建立边合成边测序的位点 加入聚合酶和被Cy3荧光标记脱氧核苷酸进行DNA 合成,每次只加入一种脱氧核苷酸,然后将未参与合成的dNTP和DNA聚合酶洗脱,直接对Cy3成像,观测模板位点上是否有荧光信号,然后化学裂解核苷酸上的燃料并释放 加入下一种脱氧核苷酸和聚合酶的混合物,进行下一轮反应。

    (2)Pacific BioscienceSMRTT 技术。该测序也是基于边合成边测序的原理,这项技于Zero-ModeWaveguide(ZMW)(零级波导)。测序的过程:被荧光标记磷酸集团的核苷酸在聚合酶活性位点上与模板链结合(每种脱氧核苷酸被不用颜色的染料标记),被激发出荧光,在荧光脉冲结束后,被标记的磷酸集团被切割并释放,聚合酶转移到下一个位置,下一个脱氧核苷酸连接到位点上开始释放荧光脉冲,进行下一个循环。

    (3)Oxford Nanopore Technologies 的纳米孔单分子测序技术。大多数纳米孔测序技术的基本原理是当DNA分子或者它的组成碱基从一个孔洞经过时而检测到被影响的电流或光信号。OxfordNanopore 测序技术是 以α- 溶血素来构建生物纳米孔,核酸外切酶依附在孔一侧的外表面,一种合成的环糊精做为传感器共价结合到纳米孔的内表面。这个系统被镶嵌在一个脂双分子层内,为了提供既符合碱基区分检测又满足外切酶活性的物理条件,脂双分子层两侧为不同的盐浓度 在适合的电压下,核酸外切酶消化单链 DNA,单个碱基落入孔中,并与孔内的环糊精短暂的相互作用,影响了流过纳米孔原本的电流,腺嘌呤与胸腺嘧啶的电信号大小很相近,但胸腺嘧啶在环糊精停留是时间是其他核苷酸的2-3倍,所以每个碱基都因其产生电流干扰振幅是特有的而被区分开来。

    三代测序技术特点的比较:

    三代测序技术特点的比较

    测序成本、读取长度和测序通量是评价测序技术先进与否的重要标准。测序成本是一个很重要的因素,它在一定程度上决定了基因组测序应用的普及性。在1995年,随着自动测序仪的出现,检测一个碱基的成本大约是1美元。随后到199年,使用ABI Prism® 3700 DNA Analyzer检测一个碱基的成本已经降到了0.1美元。而目前广泛使用的第二代测序技术的测序成本更低。National Human Genome Research Institute(NHGRI)预测,在未 来5年内,测序成本还将下降100倍。读取长度是指一个反应能测得数据的长度,它对测序成本和数据质量有很大的影响。更长的读取长度可以减少测序后的拼接工作量,但可能也会降低测序结果的准确性。测序通量是指在一定时间内获得的数据输出量。仪器的测序通量是指在样品准备充分的前提下,测序仪每24小时产生的数据量。更高的测序通也能够在一定程度上降低测序成本、提高科研工作的效率。 第二代测序技术与第一代测序技术Sanger测序法的原理都是基于边合成边测序的思想,在测序原理上没有本质的飞跃,那么测序的时间和费用都大大降低的原因是什么呢?其关键在于第二代测序技术采用了高通量测序技术,使测序通量大大提高,从Sanger测序法一次读取一条序列到毛细管测序的一次读取96条序列再到现在的一次读取几百万条序列的实现,不得不说这是对第一代测序技术的一次革命性的变革。 然而第二代测序技术并不完美,由于其在测序前要通过PCR手段对待测片段进行扩增,因此增加了测序的错误率。并且由于Illumina和SOLiD的测序结果都较短,比较适合重测序,而不太适用于没有基因组序列的全新测序。第三代测序技术解决了错误率的问题,通过增加荧光的信号强度及提高一起的灵敏度等方法,使测序不再需要pcr扩增这个环节,实现了单分子测序并继承纳米孔单分子结构(下图)

    单分子测序并继承纳米孔单分子结构

    目前正在研发的纳米孔单分子技术则更是在原理上做出本质变革,不再基于目前所用测序技术广泛使用的边合成边测序的思想,而是使用外切酶从ssDNA的末端逐个切割形成单碱基,并采用新技术对切落下来的单碱基进行检测,这样可以更好地提高读取长度,减少测序后的拼接工作量,实现对未知基因组进行重新测序。 高通量是第二代和第三代测序技术的共同特点。由于这些测 序技术一次可获得上百万条、甚至几百万条序列信息,因此可对某一组织、某一时间表达的所有mRNA进行序列测定,故又被称为深度测序。由于使用高通量测序技术可以实现对不同组织mRNA表达差异进行检测,通过与基因组进行比较可以确定组织特异表达的基因,因此具有取代"基因芯片"技术的动态。由于基因芯片的检测范围取决于芯片上探针的信息,因此只能检测人们已知序列的特征,缺乏发现寻找新基因的能力,而高通量测序则能够很好地弥补基因芯片这方面的不足。但就目前而言,高通量测序技术建立的时间还很短,技术不是很成熟,其信息储备量也很有限;而基因芯片技术已经发展了近16年,其实验技术及后期数据分析理论已经很成熟很完备,也积累了庞大的公共数据库因此短时间内基因芯片技术还会占据主导优势。但相信在不久的将来,高通量测序技术将会越来越成熟并得到更加广泛的应用。

    综上所述:随着科技的进步,时间的推移以及科研人员进一步研究与实施,最新的技术总是要替代第一代技术,因为无论是从时间成本、数据大小、项目更新等一些列问题,新一代的测序方法会完全取代老一代产品。

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